Biofizyka pojedynczych cząsteczek w erze wysokoprzepustowych badań
Zdolność do badania dużych bibliotek sekwencji DNA, RNA i białek na poziomie pojedynczych cząsteczek od dawna jest głównym celem w biofizyce, gdyż obiecuje przeniesienie badań molekularnych na całkiem nowy poziom. „Umożliwienie naukowcom badania dynamiki i interakcji poszczególnych cząsteczek zapewniłoby głębsze zrozumienie procesów biologicznych”, mówi Chirlmin Joo(odnośnik otworzy się w nowym oknie), biofizyk z Uniwersytetu Technicznego w Delft(odnośnik otworzy się w nowym oknie). „Otworzyłoby to również drzwi do nowych metod leczenia zaburzeń genetycznych, raka i wielu innych chorób”. W pokonaniu tej długotrwałej przeszkody pomaga projekt MIGHTY_RNA, który otrzymał wsparcie ze strony Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych(odnośnik otworzy się w nowym oknie). Sercem tej inicjatywy jest SPARXS – innowacyjna platforma, która łączy pomiary fluorescencji pojedynczych cząsteczek z sekwencjonowaniem nowej generacji, umożliwiając wysokoprzepustowe, specyficzne dla poszczególnych sekwencji badania biofizyczne. „To przełomowe rozwiązanie pozwala na jednoczesną charakterystykę kinetyczną i strukturalną milionów cząsteczek z tysiącami unikalnych sekwencji”, podkreśla Joo. Pozwala to w szybki sposób uzyskać wiedzę na temat ich kształtu i zachowania.
Pokonywanie wyzwań
Opracowanie platformy SPARXS wymagało od naukowców przezwyciężenia szeregu problemów. Jednym z nich było zapewnienie kompatybilności między detekcją fluorescencji pojedynczych cząsteczek i procesami sekwencjonowania na tej samej komercyjnej komórce przepływowej stosowanej do sekwencjonowania. Na początku naukowcy nie byli nawet pewni, czy to zadziała, ponieważ nie mieli bezpośredniej kontroli nad warunkami panującymi wewnątrz komórki przepływowej. „Osiągnięcie fluorescencji na poziomie pojedynczej cząsteczki [wolnej od szumów tła] w tym środowisku wymagało ponownego opracowania strategii wykrywania od początku”, zauważa Joo. „To był ogromny krok naprzód, który umożliwił stworzenie platformy SPARXS”. Co więcej, aby zestawić ze sobą ogromne zbiory danych z mikroskopii fluorescencyjnej i sekwencjonowania, zespół projektu musiał opracować specjalnie dostosowane algorytmy zdolne do precyzyjnego łączenia danych. Zbiory danych, wraz z pełnym oprogramowaniem wykorzystanym w projekcie, powstały w modelu otwartego dostępu(odnośnik otworzy się w nowym oknie).
Jeden eksperyment – tysiące unikalnych sekwencji
Korzystając z rozwiązania SPARXS, naukowcy byli w stanie przeanalizować zachowanie kinetyczne ponad 4 000 unikalnych sekwencji DNA w ramach jednego eksperymentu. Joo uważa, że praca ta nie tylko oferuje nowe spojrzenie na dynamikę molekularną zależną od sekwencji, ale także dostarcza solidnych, uniwersalnych ram, które można stosować do badania białek, RNA i innych biocząsteczek. „Platforma SPARXS wytycza nowe ścieżki do badania relacji między sekwencją, strukturą i funkcją na niespotykaną dotąd skalę, a bycie świadkiem tego, jak ta koncepcja się urzeczywistnia i zostaje doświadczalnie zweryfikowana, stało się punktem zwrotnym w mojej karierze”, dodaje.
Wpływ zmian sekwencji na zachowanie molekularne
Zespół projektu MIGHTY_RNA przesunął granice biofizyki pojedynczych cząsteczek, wprowadzając ją do świata badań o wysokiej przepustowości, ale nie zamierza spocząć na laurach. Obecnie uczeni koncentrują się na rozszerzeniu zakresu zastosowania platformy SPARXS poza kwasy nukleinowe, dostosowując ją do wymogów badań nad interakcjami między białkami i ligandami oraz białkami i peptydami. Ponadto zespół projektu sprawdza możliwość analizy danych z platformy SPARXS za pomocą metod uczenia maszynowego. Takie połączenie mogłoby umożliwić platformie przewidywanie interakcji i dynamiki cząsteczek, zwiększając w ten sposób jej potencjał w zakresie opracowywania nowych leków i biologii syntetycznej. „Łącząc rozdzielczość technik umożliwiających badanie na poziomie pojedynczej cząsteczki ze skalą oferowaną przez metody o wysokiej przepustowości, platforma SPARXS pozwala naukowcom na systematyczną analizę wpływu zmian sekwencji na zachowanie molekularne, co może mieć szereg zastosowań – od biofizyki podstawowej po badania przekładające się na praktyczne zastosowania biomedyczne”, podsumowuje Joo. Obecnie uczony przyjmuje zgłoszenia(odnośnik otworzy się w nowym oknie) od osób i podmiotów chcących podjąć współpracę, zainteresowanych zastosowaniem platformy SPARXS do innych systemów biologicznych.
